様々な濃度のM.tuberculosisを含有する完全フロイントアジュバント(CFA)をご用意しています。実験目的や免疫スケジュールにより適したM.tuberculosis濃度を選択してください。

製品番号製品名M. Tuberculosis
H-37 RA
容量価格在庫詳細情報
7002Incomplete Freund's Adjuvant5 ml¥8,000在庫情報 データシート
7008Complete Freund's Adjuvant1 mg/ml5 ml¥9,000在庫情報 データシート
7009Complete Freund's Adjuvant2 mg/ml5 ml¥11,000在庫情報 データシート
7015Complete Freund's Adjuvant3 mg/ml5 ml¥11,000在庫情報 データシート
7001Complete Freund's Adjuvant4 mg/ml5 ml¥16,000在庫情報 データシート
7023Complete Freund's Adjuvant5 mg/ml5 ml¥21,000在庫情報 データシート
7027Complete Freund's Adjuvant10 mg/ml5 ml¥30,000在庫情報 データシート
7024Complete Freund's Adjuvant20 mg/ml5 ml¥56,000在庫情報 データシート

エマルションの作製および投与方法

CIAによる関節炎惹起を行う際、II型コラーゲンとCFAでエマルションを作製します。エマルションの品質と投与方法は、関節炎惹起の成否の半分以上を占める非常に重要な操作となります。安定した良いエマルションを用いないと、うまく免疫されず関節炎が惹起されません。使用されるホモジナイザーはお客様ごとに異なりますので、全てのお客様に共通したエマルション作製プロトコルはありません。

その為、必ず品質チェックが必要になります。良いエマルションが出来た際には、その作製方法(回転数、撹拌時間など)を記録し、次回から同じ内容で作製することで安定した実験を行ってください。また、シリンジを2つ繋げた手動でのエマルション作製は、シリンジを押す力・スピード・回数などにより出来上がりがばらつき、毎回安定したエマルションの作製が困難な為、推奨いたしません。

エマルション作製方法

  1. シリンジにCFAを入れる。
  2. ホモジナイザーで低速で撹拌しながらCFAと同容量のII型コラーゲン溶液をゆっくり滴下する。
  3. コラーゲン溶液が完全に入ったら、2分間高速回転で撹拌する。回転中はシリンジを上下左右に動かし、シリンジ内のエマルションが均一に混ざるようにする。
  4. 3-5分ほど静置してシリンジを冷やし、再度3の操作を行う。
  5. 3-5分ほど静置してシリンジを冷やし、再度3の操作を行う。
  6. 完成したエマルションを水面へ滴下して品質チェック※をする。

完成したエマルションを水に垂らします。水面を揺らしても1滴1滴がそのまま表面に浮いている状態でないといけません。
滴下したエマルションが水面に膜を張るような状態では不十分ですので、再度温めないようにホモジナイザーで撹拌する必要があります。完成後は4℃にて保存し、1-2時間以内に使用することも重要です。

※品質チェック法

品質チェック法
未完成のエマルションを水に垂らすと、写真のように水面に分散してしまいます。再度撹拌し、良い状態に作製したエマルションは、矢印のように1滴1滴が崩れることなく浮いています。

投与方法

一般的にマウスの尾への免疫が使われております。

背中や首などに免疫すると、免疫部位の炎症が広範囲になり、炎症性サイトカインを産生するマクロファージなどがその部分に蓄積し、関節へ移行する割合が減ることで関節炎が起きにくくなるとされています。

また、尻尾であっても体に近すぎると、付け根や肛門に炎症が集中してしまい、手足に関節炎が惹起されないこともございます。

Chondrexでは皮下投与を推奨しております。下記の図をご参照ください。

皮下投与

免疫スケジュール例

マウスの系統と実験の目的に応じて、発症率と重症率の高い関節炎を誘発する方法は複数ございます。使用するマウスの系統や実験目的だけでなく、参考とする文献や使用する動物実験施設の規範に応じて最適なプロトコルを決定してください。

a) CIA高感受性のマウスを使用した追加免疫なしの単回免疫による関節炎の誘発

マウスにコラーゲンと最終濃度2 mg/mlのM. Tuberculosis(結核菌)を含むCFAのエマルションを投与します。

関節炎は、DBA / 1J(H-2q)マウスやB10.RIII(H-2r)マウスなどのCIA高感受性マウスで免疫後28〜35日で発症します。

関節炎の発生率は、これらの系統で42〜56日で90〜100%です。関節炎の重症度は高く、スコア10〜12(最大スコア16)に達します。

※結核菌の濃度が高いため、注射部位の炎症は重度となります。そのため一部の施設では実施できない可能性がございます。
その場合、次のプロトコル(b)または(d)のいずれかを参照ください。

b) CIA高感受性のマウスを使用した追加免疫による関節炎の誘発

マウスにコラーゲンと最終濃度0.5 mg/mlのM. Tuberculosisを含むCFAのエマルションを投与します。

21日目に、コラーゲンとIFAのエマルションを用いて追加免疫注射をします。
追加免疫注射は、初回の注射部位とは異なる場所に投与してください。

関節炎は初回の免疫から28〜35日後に発症します。関節炎の発生率は約80〜100%で、
関節炎の重症度は42〜56日でスコア8〜12(最大スコア16)に達します。

c) CIA抵抗性マウスを使用した高濃度M. Tuberculosisアジュバントを
 用いた関節炎の誘発

CIAは、B10(H-2b)、C57BL / 6(H-2b)、およびC57BL / 6x129 / Sv(H-2b)などのいくつかのCIA抵抗性マウス系統においても誘発されます。

マウスにコラーゲンと最終濃度2.5 mg/mlのM. Tuberculosisを含むCFAのエマルションを投与します。

21日目に、コラーゲンと最終濃度2.5 mg/mlのM. Tuberculosisを含むCFAのエマルションを用いて追加免疫注射をします。

関節炎は初回の免疫から28〜35日後に発症します。これらのマウスにおける関節炎の最大発生率は、42-56日で約50-70%です。

※結核菌の濃度が高いため、注射部位の炎症は重度となります。そのため一部の施設では実施できない可能性がございます。
その場合、コラーゲン抗体関節炎(CAIA)モデルをご検討ください。詳細につきましてはこちらをご確認ください。

d) LPS投与による関節炎発症のコントロール

LPSはII型コラーゲンに対する自己抗体産生誘導と関節炎誘導に相乗効果があります。

さらに、CIAの重症度と発症率はLPS[B細胞マイトジェン]やMycoplasma arthritidis[T細胞マイトジェン](MAM)、
ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)によって増加します。

これらの細菌毒素は関節炎を誘発および増強するだけでなく、関節炎の発症時期をコントロールするためにも使用可能です。

このプロトコルではプロトコル(b)に従って、マウスにコラーゲンと最終濃度0.5 mg/mlのM. Tuberculosisを含む
CFAのエマルションを投与します。

25~28日目あるいは関節炎の発症の3~5日前にLPS(生理食塩水中に25~50mg)を腹腔内(IP)投与します。

関節炎は投与から24~48時間以内に90~100%のマウスで発症します。

※CFAで免疫したマウスは初回免疫から2~4週間に重度の免疫抑制状態になります。
そのため一部のマウスはLPS投与(50mg)に非常に敏感です。

本実験に進む前に、動物飼育室ごとに同一プロトコルで異なるベンダーの動物をテストすることを推奨しております。

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